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1、引物二聚体（pcr引物二聚体特别亮）
引物二聚体（pcr引物二聚体特别亮）引物二聚体(pcr引物二聚体特别亮)
基本原理
聚合酶链反应是一种体外特异性核酸序列扩增技术。模拟DNA的自然复制过程包括三个基本反应步骤:变性-复性-延伸。根据靶序列DNA片段两端的核苷酸序列，合成了两条不同的寡核苷酸引物，与两条DNA链互补。将适量的寡核苷酸引物与四种脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)混合。DNA聚合酶和含有靶序列片段的模板DNA分子。经过高温变性(解开DNA双链)、低温复性(将引物附着在模板上)和中温延伸(合成新的DNA片段)三个阶段的一个循环后，DNA的量可以增加一倍，然后经过30个循环后，DNA的量可以增加230倍。
典型的聚合酶链反应体系和三阶段聚合酶链反应
典型的聚合酶链反应系统组成:
脱氧核糖核酸模板
反应缓冲液
两条合成DNA引物:dNTP和MgCl2(分别为上游引物和下游引物)
耐热Taq DNA聚合酶等。
聚合酶链反应的三个阶段如下:
模板DNA的变性:将模板DNA加热到94℃左右一定时间后，将模板DNA双链或PCR扩增形成的双链DNA解离，使其与引物结合，为下一轮反应做准备；
模板DNA和引物的复性:当温度降至55℃左右时，引物与模板DNA单链互补序列配对；
引物延伸:在Taq DNA聚合酶的作用下，以四种dNTP为反应原料，以靶DNA序列为模板，根据碱基配对和半保守复制的原理，通过DNA模板-引物偶联，合成了一条与模板DNA链互补的新型半保守复制链。反复变性-复性-延伸可以获得更多的半保守复制链，而这条新链可以成为下一个循环的模板。
实验用品
1.材料
枯草芽孢杆菌AS 1.398基因组DNA溶液
2.试剂
2×Taq酶PCR反应混合物(含Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、氯化镁和4种dNTP)；
上游引物，下游引物
石蜡油；
琼脂糖；
10×TBE电泳缓冲液:称取Tris108g、硼酸55g、Na2EDTA7.44g、双蒸水至1000mL
6×加载缓冲液:0.25%溴酚蓝，40%(w/v)蔗糖水溶液；
EB溶液母液:将EB配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹；
脱氧核糖核酸纯化试剂盒
DL2000TM基因标记
3.工具
超净工作台
加压釜
高速离心机
移液管
聚合酶链反应放大器
水平电泳槽
电泳仪电源
凝胶成像系统
电饭锅/电炉
实验步骤
底漆设计
在NCBI寻找枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶的基因序列，并使用枯草芽孢杆菌亚种的碱性磷酸酶基因序列。以枯草芽孢杆菌str.168为模板设计引物。根据表达质粒载体pET-28a-c (+)的DNA序列和图谱，用Primer Premier 5.0软件设计了两对引物。上游引物和下游引物分别具有BamH和Hind的限制性酶位点，这两个不同的限制性酶识别位点分别在引物中加下划线。引物序列如下:
上游引物:
5 '-cgggatccattaaaaaaaagatttgt-3 '(BamHⅰ)
下游引物:
5 '-ccgaagcttttattttccagtttt-3 '(Hindⅲ)
基因增殖
以提取的基因组DNA为反应模板，用合成的引物通过聚合酶链反应扩增编码ALF的DNA序列。
加入上述试剂后，离心5 s并混合均匀，加入20 μL石蜡油覆盖混合物，防止PCR过程中样品中水分蒸发。
当所有反应完成后，将PCR仪的温度设置为保持在4℃。反应后，每个样品用1%琼脂糖凝胶电泳检测5μL，基因长度约为1400bp。添加样本DL2000TM标记作为电泳标记。电泳后，在凝胶成像系统中观察结果并拍照。
产品净化
用DNA纯化试剂盒进行纯化，具体步骤如下:
(1)聚合酶链反应后，将反应液从聚合酶链反应管转移到干净的1.5毫升埃彭道夫离心管中，加入4倍体积的结合缓冲液混合均匀。将纯化柱放入收集管中，将混合溶液转移到柱中，并在室温下放置2分钟。
(2)以12000转/分钟的速度离心1分钟。
(3)倒出收集管中的废液，将净化柱放入同一收集管中，加入600 μ l洗涤液，以12000 r/min离心1 min。
(4)重复步骤(3)一次。
(5)倒出收集管中的废液，将净化柱放入同一收集管中，以12000 r/min离心2分钟。
(6)将3S柱放入另一个1.5 mL离心管中，在纯化柱膜中心加入30 μ L TE，37℃静置2 min。
(7)以7)12000 r/min离心1 min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或在-20℃保存备用。
需要注意的事项
1.1的灵敏度。PCR反应非常高。为了防止污染，所用的0.2毫升埃彭道夫管和吸头必须是新的、无污染的、无酶的。实验操作应尽可能在无菌手术台上进行。
3.使用工具酶和DNA样本的操作必须在冰浴条件下进行，使用后的剩余应立即放回冰箱。
3.应该有一个阴性对照，包含除模板DNA以外的所有其他成分。
4.所用引物的浓度一般为0.1 ~ 1.0 μ mol/L，浓度过高容易形成引物二聚体或增加非特异性产物。过低会影响效率。
5.聚合酶链反应产物应通过电泳鉴定，在纯化和回收聚合酶链反应产物之前，可以获得相同分子大小的目标条带。
结果分析
拍摄聚合酶链反应产物的凝胶电泳结果并进行分析。
2、定量PCR常见问题与解答
一、无 Ct 值（信号）出现
1、反应循环数不够：一般都要在 35 个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于 45 个循环会增加过多的背景信号；
2、检测荧光信号的步骤有误：一般采用 72℃延伸时采集荧光，Taqman 方法则一般在退火结束或延伸结束采集信号；
3、引物或探针降解：可通过 PAGE 电泳检测其完整性；
4、探针设计不佳：设计探针温度低于引物，造成探针未杂交上而产物已延伸；
5、模板量少：对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起； 6、模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的情况发生。
二、如何确认模板中是否含有 PCR 反应阻害物质？
有时 RNA 或 cDNA 模板中存在对反转录和荧光 PCR 反应的阻害物质。为了确认这样的阻害物质的有无，我们可以使用高浓度的模板按 3－4 个梯度稀释，并使用其进行荧光定量 PCR 反应。如果无阻害物质存在，得到的 Ct 值就会依模板浓度的变化而变化；而如果模板中有阻害物质的存在，实验过程中我们就会发现高浓度的模板有反应性能下降的现象。 三、Ct 值出现过晚
1、反应条件不佳：为达到最佳反应条件，可重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等；
2、PCR 各种反应成分的降解或加样量不够； 3、扩增产物片段过长：一般采用 100－200bp 的扩增长度。
四、标准曲线的线性关系不佳
1、加样存在误差，标准品稀释不呈梯度； 2、标准品降解：标准品尽量避免反复冻融； 3、引物或探针不佳：重新设计；
4、模板中存在抑制物，或模板浓度过高。 五、阴性对照也出现明显的扩增
1、荧光 PCR mix 或水被污染；
2、引物二聚体的出现：在 35 循环后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合溶解曲线进行分析；
3、反应过程中探针降解：用 PAGE 电泳对探针进行检测；
六、溶解曲线不止一个主峰
1、引物设计不佳：避免二聚体和发夹结构的出现；
2、引物浓度不佳：适当调整引物浓度；
3、退火温度低：提高退火温度；
4、镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度； 5、模板中有基因组的污染：RNA 提取过程中避免基因组 DNA 的污染，或通过引物设计避免非特异扩增。
七、如何避免荧光定量 PCR 中基因组 DNA 扩增？
1、引物设计时避免基因组 DNA 扩增；
2、在 RNA 提取过程中使用 DNaseⅠ处理去除 RNA 中混有的基因组 DNA。
八、扩增效率低
1、反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解；
2、反应条件不佳：适当降低退火温度或改为三步扩增法；
3、反应体系中有抑制物：一般为模板中引入，应先把模板适当稀释，再加入到体系中，减少抑制物的影响；
九、重复性不好
1、加样不准确；
2、仪器在样品上温度条件有差异，温度均一性不好；
3、模板浓度低：样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。
十、扩增曲线不正常，刚进入指数期就很快进入平台期并向右下弯曲
1、基线等设置不当：按仪器说明书重新操作；
2、模板量过多：当扩增曲线在 10 个循环内起峰时，应将模板稀释 100－1000倍后使用。
十一、各孔间的荧光信号如何进行校正 由于加样操作的误差、离心管透光性能的差异、荧光激发效率的差异等偶然误差不可避免，因此仪器收集到的原始信号必须进行归一化校正，以消除这些因素对定量结果的影响。这种校正可以通过在反应体系中添加额外的荧光染料来实现，一般采用红色 ROX 荧光，称为阳性参比信号。ROX 在反应缓冲液中的浓度是固定的，因此其信号的强度与反应体系的总体积和总的荧光激发效率正相关。ROX校正可以提高定量数据的精度和重现性，减少孔间差异。 十二、荧光定量 PCR CT 值一般在多少后认为模板没扩增？ 当进入对数期的循环数大于 35 时，RealTime RT-PCR 检测无效，基因没有表达；当进入对数的循环数在 32-35 个循环时，需要有至少 3 个重复才能判断是否能检测到基因的表达。
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